賽默飛Qubit 4.0熒光計檢測出的濃度比預(yù)期高（或者比其他方法如Nanodrop高），通常不是儀器本身故障或誤差，而是由于其獨特且高度特異的工作原理以及樣品本身的性質(zhì)造成的。以下是導(dǎo)致Qubit 4.0檢測濃度“偏高"的幾個主要原因，按重要性排序：

一、核心原因：檢測原理的根本不同 (最關(guān)鍵的一點)

1、Qubit 4.0 - 特異性熒光檢測：

Qubit使用一種只有與特定目標(biāo)分子（如dsDNA、RNA、蛋白質(zhì)） 結(jié)合后才會發(fā)出強烈熒光的染料。

染料不會與蛋白質(zhì)、游離核苷酸、鹽離子、溶劑或其他常見污染物結(jié)合并發(fā)光。

結(jié)果：Qubit只報告您想要測量的特定目標(biāo)分子的濃度。它幾乎忽略了所有雜質(zhì)。

2、其他方法（如Nanodrop） - 紫外吸光度（UV Absorbance）：

Nanodrop基于260nm波長下的吸光度原理。任何在該波長下能吸光的物質(zhì)都會貢獻(xiàn)讀數(shù)。

這包括：dsDNA, ssDNA, RNA, 游離核苷酸, 蛋白質(zhì), 苯酚, 胍鹽等常見污染物。

結(jié)果：Nanodrop報告的是樣品中所有吸光物質(zhì)的總和，通常會高估純凈目標(biāo)分子（如dsDNA）的實際濃度。

結(jié)論：當(dāng)您說Qubit濃度“更高"時，很可能是在與Nanodrop對比。在大多數(shù)情況下，Qubit的結(jié)果更準(zhǔn)確，而Nanodrop因為包含了雜質(zhì)的信號而虛高了。Qubit顯示的是“有效濃度"，而Nanodrop顯示的是“總吸光物質(zhì)濃度"。

二、使用了錯誤的標(biāo)準(zhǔn)曲線或試劑

Qubit的精確度極度依賴于使用正確的、新配制的標(biāo)準(zhǔn)品來生成校準(zhǔn)曲線。

1、使用了錯誤的 assay：例如，您想測的是RNA，但錯誤地選擇了“dsDNA HS"檢測程序。不同assay的染料和標(biāo)準(zhǔn)曲線不同，交叉使用會導(dǎo)大的誤差。

2、標(biāo)準(zhǔn)品降解或污染：標(biāo)準(zhǔn)品如果反復(fù)凍融、保存不當(dāng)或過期，其濃度會不準(zhǔn)，導(dǎo)致繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率錯誤，從而使所有未知樣品的計算結(jié)果產(chǎn)生系統(tǒng)偏差（可能偏高也可能偏低）。

3、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤：制備工作液時，必須嚴(yán)格按照說明書操作。如果加入的染料太多或標(biāo)準(zhǔn)品量不準(zhǔn)，都會影響結(jié)果。

三、樣品本身的問題

1、含有干擾熒光讀數(shù)的物質(zhì)：雖然Qubit染料特異性很強，但高濃度的某些污染物（如某些去垢劑）可能會影響熒光本身，導(dǎo)致讀數(shù)異常。

2、樣品超出檢測范圍：每個Qubit assay都有其線性范圍（如dsDNA HS assay是0.2-100 ng）。如果您的樣品濃度遠(yuǎn)高于上限，即使儀器自動稀釋，也可能因進(jìn)入非線性區(qū)域而導(dǎo)致計算結(jié)果不準(zhǔn)確。務(wù)必確認(rèn)樣品濃度落在所用assay的推薦范圍內(nèi)。

四、總結(jié)與建議

當(dāng)您發(fā)現(xiàn)Qubit 4.0濃度偏高時，請遵循以下排查流程：

1、首先確認(rèn)對比對象：如果是在與Nanodrop對比，通常信任Qubit的結(jié)果。它的特異性更強，結(jié)果更可靠，尤其對于純度不高的樣品。

2、雙重檢查實驗流程：

我是否選擇了正確的檢測程序？（dsDNA, RNA, Protein等）

我使用的標(biāo)準(zhǔn)品和染料工作液是否新配制？是否在有效期內(nèi)？

我是否讓反應(yīng)液孵育了足夠長的時間（至少2分鐘）？

我是否擦拭了試管？

3、檢查樣品狀態(tài)：我的樣品濃度是否在** assay的線性范圍**內(nèi)？如果過高，請用緩沖液進(jìn)行稀釋后重新測量。

4、運行診斷：Qubit 4.0儀器本身通常很穩(wěn)定。如果懷疑儀器問題，可以運行內(nèi)置的“性能驗證"（Performance Verification）測試，使用隨機的驗證板來確認(rèn)儀器和探頭的功能是否正常。

絕大多數(shù)情況下，濃度“偏高"的現(xiàn)象根源在于Qubit更高的特異性凸顯了其他方法（如紫外吸光度）的誤差。