?

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）實(shí)驗(yàn)包含多個步驟，完成一輪常規(guī) PCR 反應(yīng)后，接下來常見的步驟及后續(xù)操作有以下這些情況：

一、產(chǎn)物檢測

1、瓊脂糖凝膠電泳檢測：

制備合適濃度（通常根據(jù)產(chǎn)物大小等因素選擇，比如檢測幾百 bp 的片段可能用 1% - 1.5% 瓊脂糖凝膠）的瓊脂糖凝膠，將 PCR 產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合后，加入到凝膠的加樣孔中，同時加入合適的 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（如 DNA Marker）作為對照，在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，之后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)，以此判斷 PCR 擴(kuò)增是否成功以及產(chǎn)物特異性等情況。

2、熒光定量 PCR 檢測（如果是實(shí)時熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)）：

通過相應(yīng)的熒光定量 PCR 儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增曲線、熔解曲線等數(shù)據(jù)，來確定目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù)、判斷擴(kuò)增的特異性等，比如觀察熔解曲線是否為單一峰，單一峰往往意味著擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，如果出現(xiàn)雜峰可能提示有非特異性擴(kuò)增等情況。

二、產(chǎn)物純化（若后續(xù)有需要）

1、柱式純化：

利用硅膠膜柱在特定緩沖液條件下對 DNA 有吸附作用，而雜質(zhì)等可以被洗脫去除的原理，先將 PCR 產(chǎn)物加到柱子上，經(jīng)過結(jié)合、洗滌等步驟，最后用低鹽緩沖液或純水將吸附在柱子上的 DNA 洗脫下來，得到純化后的 PCR 產(chǎn)物，可用于后續(xù)的克隆、測序等操作。

2、磁珠純化：

基于磁珠表面修飾的基團(tuán)能與 DNA 特異性結(jié)合，在磁場作用下方便進(jìn)行分離操作，通過一系列結(jié)合、清洗、洗脫步驟，去除雜質(zhì)和多余的引物、dNTP 等，獲取純化的 PCR 產(chǎn)物。

三、克隆測序（針對需要進(jìn)一步分析基因序列等情況）

1、連接反應(yīng)：

將純化后的 PCR 產(chǎn)物與合適的克隆載體（如常見的 pUC 系列載體等）在 DNA 連接酶的作用下進(jìn)行連接，使 PCR 產(chǎn)物插入到載體中構(gòu)建重組 DNA 分子，一般要在合適的連接體系（包含載體、插入片段、連接酶、緩沖液等）、適宜的溫度（如 16℃左右過夜連接等）條件下進(jìn)行操作。

2、轉(zhuǎn)化：

把連接產(chǎn)物導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞（如大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞）中，通過熱激法（將細(xì)胞和連接產(chǎn)物混合后冰浴、短暫熱激、再冰浴等步驟）或電轉(zhuǎn)化法（利用電穿孔技術(shù)使細(xì)胞攝取外源 DNA）等方式，使細(xì)胞獲得重組質(zhì)粒，然后將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。

3、挑取克隆及測序：

從平板上挑取單克隆菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送往專業(yè)的測序公司或者利用實(shí)驗(yàn)室自己的測序儀器進(jìn)行測序，以獲得準(zhǔn)確的 PCR 產(chǎn)物的堿基序列信息，便于后續(xù)的序列比對、變異分析等工作。

四、后續(xù)功能驗(yàn)證（在基因表達(dá)調(diào)控等相關(guān)研究中）

1、構(gòu)建表達(dá)載體（如果是針對基因功能研究）：

將 PCR 擴(kuò)增得到的目的基因片段插入到合適的表達(dá)載體（比如真核表達(dá)載體 pcDNA 系列等用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的基因）中，然后通過轉(zhuǎn)染等方式（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染等）將表達(dá)載體導(dǎo)入到相應(yīng)的細(xì)胞系中，使細(xì)胞表達(dá)目的基因產(chǎn)物，后續(xù)可以通過檢測蛋白表達(dá)水平（如 Western blot 等方法）、細(xì)胞表型變化等，來研究該基因的功能特性。

具體下一步驟要根據(jù) PCR 實(shí)驗(yàn)的最初目的、后續(xù)的應(yīng)用需求等來確定。